Identificación de genes de respuesta al SINTROM^® (Acenocumarol) mediante análisis de asociación en genes candidatos: planteamiento general

Rodolfo Sixto Negri

Resumen

En el presente trabajo se ha llevado a cabo la preparación de un proyecto de investigación, en el cual, por medio de un estudio de asociación de tipo genes candidatos, se pretende identificar algunos de los genes que afectan al efecto diferencial del SINTROM^® (Acenocumarol) entre las distintas personas. Enmarcado dentro de la Medicina Personalizada, el proyecto presentado permitirá, una vez se lleve a cabo, determinar a priori la dosis de SINTROM^® que un paciente necesita, o por lo menos aproximarse a dicha dosis. En el presente trabajo, se determina cuales han de ser los datos necesarios a recoger de cada individuo que participe en el estudio, se desarrolla un modelo de consentimiento informado para su uso en el estudio y mediante el uso de herramientas bioinformáticas se lleva a cabo una selección de genes candidatos. Finalmente, se ha realizado una búsqueda de SNPs en los genes candidatos seleccionados y una selección de aquellos que deberían formar parte del estudio de asociación.

Estado actual del tema

El SINTROM^® (Acenocumarol) es el anticoagulante oral más usado en nuestro país y uno de los más usados a nivel mundial, y al igual que la warfarina (cumarina) actúa y se metabolizan igual (Medicom, 2005). Está ampliamente demostrada su efectividad en la prevención del accidente cerebrovascular en los pacientes con fibrilación auricular. El SINTROM^® es un anticoagulante que actúa inhibiendo la acción de la vitamina K sobre la carboxilación de ciertas moléculas de ácido glutámico localizadas en los factores de coagulación II (protrombina), VII, IX, X y en la proteína C y sin la cual no puede desencadenarse la coagulación sanguínea. Prolonga el tiempo de tromboplastina a las 36-72 horas aproximadamente, según la dosificación inicial. El tiempo de tromboplastina se normaliza a los pocos días de retirar el medicamento. El acenocumarol se absorbe por vía oral con rapidez, con una biodisponibilidad sistémica de un 60% como mínimo. La concentración máxima (C_max) se alcanza al cabo de 1-3 horas. Debido a las variaciones interindividuales no puede establecerse ninguna correlación entre la concentración plasmática de acenocumarol y el nivel de protrombina aparente. Pacientes mayores de 70 años suelen tener concentraciones plasmáticas mayores que los jóvenes con la misma dosis diaria. La mayor parte del acenocumarol se halla en plasma, unido en un 98,7% a proteínas plasmáticas, especialmente a albúmina. El acenocumarol pasa a la leche materna en cantidades prácticamente no detectables pero atraviesa la barrera placentaria. Se metaboliza intensamente dando lugar a metabolitos, al parecer, farmacológicamente inactivos en el ser humano. Su vida media de eliminación plasmática es de 8-11 horas. Sólo el 0,12-0,18% de la dosis se excreta inalterado en la orina. La excreción acumulativa de metabolitos y de sustancia activa inalterada durante ocho días se eleva al 60% de la dosis en orina y al 29% de la dosis en heces (Medicom, 2005). Mientras que las dosis únicas, aunque sean muy altas, no suelen ser peligrosas, el empleo continuado de dosis diarias mayores que las requeridas para la terapéutica, puede dar lugar a manifestaciones clínicas de sobredosificación. La sensibilidad individual a los anticoagulantes orales, la cuantía de la sobredosis y el período durante el que se ha tomado el fármaco constituyen factores decisivos para la aparición y la gravedad del cuadro de intoxicación. El cuadro clínico se caracteriza principalmente por la aparición, a los 1-5 días de hemorragias en diversos órganos. Otros síntomas son taquicardia, hipotensión y trastornos de la circulación periférica a consecuencia de la pérdida de sangre, así como náuseas, vómitos, diarrea y dolores abdominales espasmódicos. Las pruebas de laboratorio pueden revelar un valor de Quick (tiempo de protrombina), extremadamente bajo, o un valor INR (Ratio Internacional Normalizado) alto, una prolongación considerable del tiempo de recalcificación o de tromboplastina y trastornos de la carboxilación de los factores II, VII, IX y X. Debido a su rango terapéutico estrecho, a su uso en pacientes ancianos y con daño en el árbol vascular, se asocia con un riesgo significativo de sangrado y requiere un monitoreo frecuente del tratamiento (Medicom, 2005). Por otra parte, las dosis de mantenimiento y la respuesta a este fármaco, en relación al efecto anticoagulante y la necesidad de ajustes, es muy variable entre los pacientes. Además, son numerosos los factores que pueden alterar su respuesta a los anticoagulantes, por ejemplo, el alcohol, el estado general y la ingestión de otros medicamentos (Medicom, 2005).

Aunque hasta el momento no se ha demostrado que ningún gen sea necesario o suficiente para determinar una asociación a la respuesta diferencial al SINTROM^®, actualmente sí se conocen varios genes implicados en dicha respuesta. Los dos únicos genes que hasta el momento han producido algún tipo de resultado positivo en estudios de asociación al efecto del SINTROM^® son el CYP2C9 (10q24.1) y el VKORC1 (16p11.2).

El gen CYP2C9 codifica una hidroxilasa dependiente del citocromo P-450 (Omura, 1999; Figura 1). Se han reportado diversas variantes alélicas de este gen, dos de los cuales son funcionalmente relevantes (Visser et al., 2004; Mark et al., 2006): los alelos CYP2C9*2 (Arg144Cys) y CYP2C9*3 (Ile359Leu). Dichas variantes tienen un metabolismo deficiente de la hidroxilación del SINTROM^®. Se ha estimado que la variante CYP2C9*3 tiene una eficiencia del 5% y la CYP2C9*2 del 12% respecto del alelo normal en relación al metabolismo del SINTROM^®. En los portadores del alelo CYP2C9*3 el clearance del SINTROM está entre un 40% y un 75% del de los homocigotos CYP2C9*1/CYP2C9*1.

Figura 1: Ubicación del gen CYP2C9

Recientemente ha sido descrita cierta resistencia al efecto del SINTROM^® asociada al gen VKORC1 (vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1; Wilms et al., 2008). La variación de este gen, parece ser la responsable de cierto porcentaje en las diferencias en la respuesta a la terapia con SINTROM^®, resultados obtenidos en pacientes que toman este anticoagulante. Este gen produce una proteína que ayuda a controlar la coagulación, factor clave sobre el que actúa el SINTROM^®. Los resultados sugieren que conocer los alelos en el gen VKORC1 podría predecir en parte la respuesta de los pacientes al anticoagulante y ayudar a ajustar la dosis desde el inicio (Wilms et al., 2008).

A pesar de haber sido utilizados en el análisis de la respuesta al SINTROM^®, así como en estudios de asociación en enfermedades complejas, los estudios poblacionales de asociación, que en su momento se consideraron una herramienta muy prometedora para la elucidación del componente genético de las enfermedades complejas, no han resultado tan efectivos como se esperaba (Zondervan y Cardon, 2004). La replicación de resultados de forma independiente, que se considera una condición sine qua non para la aceptación de una hipótesis, se ha convertido en una labor difícil en los estudios de asociación realizados, por ejemplo, en enfermedades complejas (Weiss y Terwillinger, 2000). Esta falta de reproducibilidad de los análisis de asociación ha sido intenso objeto de discusión y estudio para tratar de determinar sus causas, entre las que se mencionan la influencia del medio ambiente; la heterogeneidad tanto fenotípica como génica; la heterogeneidad étnica; el efecto limitado de la mayoría de las variables de riesgo; un tamaño muestral insuficiente; análisis de subgrupos y tests múltiples; utilización de un grupo control no adecuado; interpretación poco ortodoxa de los resultados; desviación hacia publicaciones con resultados positivos y el desconocimiento del patrón de desequilibrio de ligamiento (LD) subyacente a la región analizada (Weiss y Terwillinger, 2000; Cardon y Bell, 2001).

Recientemente, gracias a los adelantos tecnológicos en el campo de la genómica, se ha profundizado en el estudio de los patrones de desequilibrio de ligamiento a lo largo del genoma y más específicamente en los patrones de LD subyacentes a los genes candidatos y su implicación en los análisis de asociación (Patil et al., 2001; Reich et al., 2001; Gabriel et al., 2002; Phillips et al., 2003; Service et al., 2006). La necesidad de conocer el patrón de desequilibrio de ligamiento del genoma y de desarrollar nuevas estrategias más eficaces para identificar variantes de riesgo mediante análisis de asociación propició la creación en 2002 del International HapMap Project. Los objetivos de este proyecto son varios. Por un lado, pretende crear un catálogo de variantes genéticas comunes que describa la naturaleza, localización y distribución de las mismas. Por otro lado, pretende identificar los haplotipos comunes (conjuntos de SNPs que presentan un alto nivel de LD entre ellos) para facilitar su utilización como marcadores en los análisis de asociación, ya que su potencial informativo es mayor que el de marcadores individuales. Y por último, otro de sus objetivos es determinar los tagSNPs (conjunto limitado de SNPs altamente informativo sobre la variación de una región concreta del genoma) que permitan identificar específicamente esos haplotipos. La utilización de los denominados tagSNPs permitiría ampliar el número de muestras y regiones cromosómicas analizadas, al reducir el esfuerzo necesario para llevar a cabo un análisis de asociación  (The international HapMap Project, 2003).

Objetivos

Dado que es posible hoy en día llegar a conocer la variabilidad genética de los distintos genes, y el hecho de que el conocimiento de dicha variabilidad puede ser de gran ayuda a la hora de definir las conductas terapéuticas, el presente trabajo plantea la posibilidad de descubrir genes con susceptibilidad a las diferencias en cuanto el efecto del SINTROM^®. Hasta el presente han sido descritos dos genes que parecen tener asociación en la respuesta al SINTROM^®, el CYP2C9 (Visser et al., 2004; Mark et al., 2006) y el VKORC1 (Wilms et al., 2008). Como estos genes por si solos no explican más que puntualmente los efectos diferenciales en la respuesta al SINTROM^®, los objetivos del presente trabajo son:

1. Preparar un protocolo de actuación en cuanto a la recogida de muestras para el estudio de asociación planteado, lo cual incluiría desde la preparación de un “consentimiento informado” hasta la definición de los datos que han de recogerse por individuo.
2. Identificar nuevos genes candidatos susceptibles de presentar un efecto diferencial en cuanto a la acción del SINTROM^®.
3. Realizar una búsqueda y selección de SNPs en los genes candidatos seleccionados
4. Diseñar el estudio de asociación en cuanto al número de muestras a analizar y los análisis estadísticos que se llevarán a cabo una vez se realice el genotipado.

Materiales y Métodos

Selección de genes candidatos

La selección de genes candidatos se ha llevado a cabo siguiendo criterios que permitan maximizar la probabilidad de selección de genes relacionados con un efecto diferencial ante el tratamiento con SINTROM^®. Los criterios utilizados han sido los siguientes: función relevante relacionada con la coagulación, asociación a algún otro gen para el cual haya sido descrita algún tipo de relación con el SINTROM^® y existencia de trabajos previos que hayan presentado alguna relación con alteraciones fisiológicas ante la administración de SINTROM^®.

Selección de SNPs

La selección de SNPs se ha realizado utilizando la información de varias bases de datos tanto públicas como privadas: NCBI dbSNP, HapMap Project Database, y Ensemble. Con el objetivo de optimizar la utilidad de los SNPs seleccionados tanto en relación con el análisis de asociación como en relación con el análisis de la estructura haplotípica de los genes, se siguieron dos estrategias de selección de SNPs. En primer lugar, se han seleccionado todos los SNPs para los que es conocido que alteran el funcionamiento del gen o que potencialmente podrían alterarlo. Además, se ha hecho una selección complementaria de SNPs para que toda la longitud del gen sea abarcada a intervalos regulares de 1-2 kilobases (Kb). Además de la región génica, para cada gen se han analizado también 10 Kb upstream del sitio de inicio de la transcripción y 5 Kb downstream del sitio de final de la transcripción, con el objetivo de identificar cualquier variante funcional asociada a dicho gen y de realizar un análisis más completo de la estructura haplotípica.

La selección de SNPs funcionales o potencialmente funcionales se ha llevado a cabo en base a la bibliografía existente y a la utilización de diferentes programas de predicción de alteraciones producidas por SNPs. Se ha dado prioridad a SNPs codificantes no sinónimos, SNPs en 5’UTR y 3’UTR, SNPs localizados en el promotor y SNPs que alteran sitios de unión de factores de transcripción (tanto potenciales como conocidos). Sólo se han seleccionado SNPs que presentan una frecuencia conocida en poblaciones caucásicas. Los software utilizados para la predicción de funcionalidad de los SNPs han sido el PupaSNP y el PupasView.

Resultados y Discusión

Información relevante de los pacientes

En un análisis de asociación, una de los requerimientos es disponer un fenotipado de los individuos analizados lo más preciso posible. Por ello, han sido seleccionados 23 datos a recoger de cada uno de los individuos considerados en el análisis. Esta información recoge datos generales como el sexo o la edad del individuo, ya que pudiera ocurrir que existan diferencias en cuanto al efecto del SINTROM^® en relación al sexo o la edad del individuo (Tabla 1). Los datos de origen del individuo y de sus progenitores ayudarán a clasificar las muestras para que a la hora de realizar las comparaciones no surjan problemas de estratificación de la muestra, o en caso en que se analicen individuos de distintos orígenes, estos puedan ser comparados entre si, eliminando de esa forma una posible estructuración de la muestra. Precisamente, la estratificación es uno de los principales problemas que se presentan en los estudios de asociación debido a que provocan un sesgo que puede llegar a producir tanto falsos positivos como una ausencia en la detección de asociaciones genuinas (Marchini et al., 2004).

Tabla 1. Recogida de datos de los individuos analizados

Con respecto a los datos recogidos acerca de la medicación (Tabla 1), aparte de la dosis diaria de SINTROM^® se hace especial hincapié en la posible interacción entre otros fármacos, debido a que la existencia de diversas dolencias conlleva la aplicación de diversos protocolos de tratamiento, pudiendo estar la medicación prescrita interfiriendo en cierta medida con el efecto del SINTROM^®. Igualmente, debido a que el SINTROM^® actúa inhibiendo la acción de la vitamina K sobre la carboxilación de ciertas moléculas de ácido glutámico localizadas en varios factores de coagulación, su ingesta simultánea puede provocar modificaciones en el efecto del SINTROM^®.

Finalmente, se obtendrán datos acerca de la existencia de alteraciones relacionadas con el aparato circulatorio, así como las medidas y ajustes realizados en cuanto a la definición de la dosis de SINTROM^® que el paciente ha de tomar.

Con respecto a la clasificación de los individuos analizados en el estudio de asociación, los pacientes se separarán inicialmente en tres categorías. Aquellos cuya dosis de SINTROM^® no se modifica a lo largo del tiempo formarán unos de los grupos. Los que se sitúen por encima y por debajo de este intervalo formaran los otros dos grupos.

Con respecto al número de individuos necesarios para llevar a cabo el estudio, dado que en nuestro entorno existe un alto número de pacientes en tratamiento con SINTROM^®, y en base a ya se han realizado contactos previos con entidades, se cuenta con una alta disponibilidad. Un número inicial de 1000 pacientes sería un número adecuado para que las tres categorías tuviesen una representación mínima de 200 individuos.

Consentimiento informado

Se ha confeccionado un “consentimiento informado” de dos páginas (Figuras 2 y 3) que será el que se ofrezca a los individuos participantes en el estudio para que acepten o no tomar parte en la investigación propuesta. Se trata de un documento para cuya confección ha sido solicitado el consejo de la Dra. Andone Estonba, la cual ha preparado en varias ocasiones documentos de tipo “consentimiento informado”, los cuales han superado con éxito el análisis por parte del Comité de Ética.

Figura 2. Primera página del consentimiento informado

Figura 3. Segunda página del consentimiento informado

Por el momento, dado que aún no ha sido solicitada ningún tipo de subvención para llevar a la práctica el proyecto diseñado en el presente trabajo, el documento redactado no ha sido presentado al Comité de Ética, aunque creemos que debido tanto al tiempo dedicado a su confección como al visto bueno de las fuentes consultadas no tendrá problemas para superar el necesario y referido filtro.

Selección de genes candidatos

En base a los criterios definidos en cuanto a la selección de genes candidatos, ha sido realizada una selección inicial de 10 genes (Tabla 2).

Tabla 2. Genes candidatos seleccionados

Los genes CYP2C9 y VKORC1 ya habían sido identificados previamente como posibles candidatos a presentar asociación a la respuesta de SINTROM^® (Visser et al., 2004; Mark et al., 2006; Wilms et al., 2008), por lo que se ha decidido incluirlos en el estudio.

Los genes CALU, y GGCX junto con el gen de la epoxidoreductasa VKORC1 son un complejo multienzimatico ubicado en la membrana del retículo endoplasmático, la función de esta maquinaria enzimática es la de asegurar el ciclo redox de la vitamina K y la modificación de las proteínas intervinientes en la coagulación como FII, FVII, FIX, FX, y las proteínas C, S y Z.

Figura 4: Ubicación del gen CALU

El gen CALU (Figura 4) tiene efecto inhibidor sobre la gama carboxilación de la vitamina K, (Wajih et al., 2004), de vital importancia en los procesos de coagulación. Este sistema de carboxilación esta ubicado en la membrana proteica del retículo endoplasmático (Wajih et al., 2004). Parece por tanto probable que este gen pueda tener alguna relación con los efectos diferenciales del SINTROM^® ya que forma parte activa en los procesos de coagulación.

Con respecto al gen GGCX (Figura 5), cabría destacar que codifica una enzima que participa en el proceso de carboxilación del aminoácido glutamato hasta carboxiglutamato en una serie de enzimas o factores de coagulación (como el factor II, el factor VII, el factor IX o el factor X). Este proceso permite que los factores de coagulación resultantes puedan enlazarse al calcio e interaccionar con los componentes fosfolipídicos de las membranas, lo cual es necesario para que tenga lugar el proceso de la coagulación sanguínea (Cha et al., 2007). La gama glutamil carboxilasa, necesita de la colaboración de la vitamina K en su proceso de activación. Aunque estudios recientes (Rieder et al., 2007) parecen no haber encontrado asociación entre los tagSNPS definidos en este gen y diferencias en la dosis de warfarina, la posibilidad de que si esté asociado al acenocumarol ha llevado a incluirlo entre los genes selccionados.

Figura 5: Ubicación del gen GGCX

El gen POL3S (Poliserasa 3) de reciente identificación (Cal et al., 2006., 2007) esta localizado de forma adyacente al VKORC1. El hecho de que para el VKORC1 haya sido descrita asociación con respecto a la respuesta al SINTROM^®, podría estar enmascarando una asociación real de el gen POL3 (Figura 6). Ante esta situación ha sido incluido entre los genes seleccionados para el estudio de asociación.

Figura 6: Ubicación del gen POL3S

Otro de los genes que podrían estar asociados al efecto del acenocumarol es el MCFD2 (Figura 7). Ha sido descrito que mutaciones en este gen causan deficiencias combinadas de los factores V y VIII de la coagulación (Zhang et al., 2006; Jayandharan et al., 2007; Nyfeler et al., 2008).

Figura 7: Ubicación del gen MCFD2

Mayne et al. (1999) describieron por primera vez la proteína VIT. Esta proteína presenta dos dominios VWA (Whittaker y Hynes, 2002), dominios de los que es ampliamente conocido que están involucrados en la adhesión celular o en los receptores de integrinas. Una de las proteínas que también presenta este tipo de dominios es el factor von Willebrand relacionado directamente con los procesos de coagulación (Whittaker y Hynes, 2002). Parece pop tanto de interés incluir este gen en el estudio de asociación planteado.

Finalmente los genes VKORC1L1 (similar al VKORC1), y los pseudogenes VKORC1P1 y VKORC1P2 también parecen unas dianas interesantes para incluir en el presente trabajo, por la similitud en sus secuencias con respecto al anteriormente mencionado VKORC1.

Búsqueda y selección de SNPs

La selección de SNPs ha sido realizada a intervalos aproximadamente regulares. El objetivo era el de que estos SNPs se distribuyeran en intervalos de unos 5 Kb, aunque al habernos encontrado con unos genes dispares en cuanto a tamaño, se ha procedido según el caso: para los genes pequeños se han reducido algo los intervalos, mientras que para los de mayor tamaño este rango ha sido ampliado. Además del tamaño también ha influido el número de SNPs descrito para cada uno de los genes. Así, si en general, los genes de pequeño tamaño, ya de por si tenían la limitación de su longitud, a esto se le ha añadido un número de SNPs muy limitado. Además del intervalo como base para la selección de SNPs, un dato fundamental es la heterocigosidad que presentan en población caucásica. Se ha intentado que la heterocigosidad sea máxima, aunque en algunos casos ha tenido que ser seleccionados otros SNPs con una baja heterocigosidad. En relación a esta elección de SNPs, no ha sido obviado el hecho de que un SNP hubiese sido descrito en el proyecto HapMap (The International HapMap Consortium, 2003), ya que el hecho de que este presente en la base de datos de este proyecto es indicativo de calidad del propio SNP, así como sugiere que los problemas metodológicos durante el genotipado serán mínimos. También han sido seleccionados con prioridad SNPs localizados en regiones exónicas, bien produjesen modificaciones sinónimas bien fueran no-sinónimas. También han sido seleccionados SNPs de tipo missense o aquellos que producen splicing alternativo aunque sus heterocigosidades no fuesen muy altas. No se han dejado de lado las regiones 3’UTR y 5’UTR, habiéndose intentado disponer de una buena cobertura en estas zonas, y finalmente han sido seleccionados algunos SNPs fuera de la región génica con el objetivo de estudiar con profundidad la estructura haplotípica de los genes. De esta búsqueda de SNPs han resultado 68 SNPs, con una separación media de entre 1094 y 9260 pares de bases (bp) dependiendo del gen y con la presencia de tan solo tres intervalos con una distancia mayor de 12 kb entre SNPs adyacentes (2 en el gen VIT y 1 en el gen VKORC1L1). Cabría destacar que para los pseudogenes VKORC1P1 y VKORC1P2 no existen en la actualidad SNPs descritos por lo que han sido excluidos del estudio. En las tablas siguientes quedan reflejados no solo los SNPs seleccionados para el estudio de asociación sino también los que fueron pre-seleccionados en base a su heterocigosidad. Así, queda de forma más clara las razones por las que han sido seleccionados unos SNPs en vez de otros.

Tabla 3. SNPs para el gen CYP2C9 (10q24)

El gen CYP2C9 (Tabla 3) es un gen de tamaño medio, que presenta una distancia ligeramente superior a las 50 kb entre los dos SNPs más alejados de los que disponemos. El intervalo medio entre SNPs seleccionados ha sido de 5630 pb habiendo seleccionado para el estudio de asociación 10 SNPs.

VKORC1 (Tabla 4), en cambio es un gen de pequeño tamaño. Aunque no indique la longitud total del gen, la distancia entre los dos SNPs más alejados de los que disponemos es de apenas 2850 pb. Por ello han sido seleccionados los únicos 3 SNPs con una heterocigosidad aceptable. La distancia media entre SNPs adyacentes seleccionados ha sido la menor de todas: 1094 pb.

Tabla 4. SNPs para el gen VKORC1 (16p11.2)

Tabla 5. SNPs para el gen CALU (7q32)

El gen CALU (Tabla 5), con una distancia máxima entre SNPs de 32 kb ha producido 7 SNPs con un intervalo entre SNPs medio de 2 kb.

En el gen GGCX, han sido seleccionados 8 SNPs a pesar de que entre los dos SNPs con localización extrema apenas 13,5 kb (Tabla 6). esto ha sido debido a que han sido incluidos conscientemente 4 SNPs exónicos, de forma que la distancia media entre SNPs seleccionados a quedado ligeramente por debajo de las 2 kb.

Tabla 6. SNPs para el gen GGCX (2p12)

POL3S es también un gen de pequeño tamaño. Han sido seleccionados tres SNPs con una distancia media entre ellos de 1880 pb. Los tres SNPs presentan una alta heterocigosidad aparte de que dos de ellos son exónicos (Tabla 7).

Tabla 7. SNPs para el gen POL3S (16p11.2)

El gen MCFD2, con 12 kb entre sus SNPs más alejados ha producido 6 SNPs validos para el estudio de asociación por lo que la distancia media entre SNPs seleccionados adyacentes ha sido de 2 kb (Tabla 8).

Tabla 8. SNPs para el gen MCFD2 (2p21)

El gen VIT (Tabla 9) ha resultado el gen de mayor tamaño entre los seleccionados. Con cerca de 120 kb, presenta hasta 16 exones. La gran disponibilidad de SNPs con una heterocigosidad cercana a 0,5 ha conllevado que la distancia media entre los SNPs haya sido cercana al planteamiento inicial (5,9 kb). Han sido seleccionados 21 SNPs, maximizando el conjunto de SNPs exónicos.

Finalmente, el gen VKORC1L1 de 83 kb entre los SNPs situados en los extremos ha producido 9 SNPs para el estudio de asociación. La distancia media entre SNPs ha sido la mayor de los genes analizados en el presente trabajo (9,3 kb), valor que ha estado condicionado por la baja heterocigosidad de los SNPs de este gen (Tabla 10).

Tabla 9. SNPs para el gen VIT (2p22-p21)

Tabla 10. SNPs para el gen VKORC1L1 (7q11.21)

Elección de la metodología estadística a aplicar tras el genotipado de las muestras

Tal y como ha sido comentado, la típica falta de reproducibilidad de los resultados de los estudios de asociación recae sobre varios factores, entre los cuales destaca, por el hecho de que es analizable, el desconocimiento del patrón de desequilibrio de ligamiento (LD) subyacente a la región analizada (Weiss y Terwillinger, 2000; Cardon y Bell, 2001). Para conocer el patrón de desequilibrio de ligamiento de los genes analizados va a llevarse a cabo un análisis de bloques y haplotipos con el programa Haploview v.4 (Barret et al., 2005). Los criterios de inclusión de datos y parámetros de análisis utilizados deberán ser los establecidos por defecto por el programa, excepto para la frecuencia mínima del alelo menor (MAF > 0,05) y para la frecuencia mínima que presenten los haplotipos para ser tomados en cuenta en el análisis (f = 0,01). Los bloques se definirán basándose en el método de los intervalos de confianza desarrollado por Gabriel et al. (2002), utilizando los parámetros preestablecidos por el programa. El análisis de asociación también será calculado mediante el software Haploview, realizando 1.000.000 de permutaciones bien en los marcadores individualmente o en los haplotipos de los bloques para obtener un significación insesgada.

La determinación de tagSNPs, los cuales permitirán identificar específicamente los haplotipos detectados previamente, permitiendo la ampliación del número de muestras y una reducción del esfuerzo necesario para llevar a cabo un análisis de asociación se llevará a cabo mediante la utilización del algoritmo Tagger disponible también en el software Haploview. El umbral para la determinación de las tagSNPs deberá de ser de r² = 0,8 (Barret et al., 2005).

Conclusión

El presente trabajo, enmarcado dentro de lo que se denomina medicina personalizada, lleva a cabo el planteamiento general de un proyecto de investigación para el descubrimiento de genes con susceptibilidad a las diferencias en cuanto el efecto diferencial de las dosis de SINTROM^® (acenocumarol) en distintos individuos. Con respecto a las muestras se ha preparado la información que será requerida de ellas, además de haber preparado el documento de consentimiento informado pertinente. Los 8 genes candidatos finalmente seleccionados han producido, tras un riguroso análisis bioinformático, 68 SNPs cuya heterocigosidad y espaciamiento a lo largo de los genes es óptimo. Así, se desarrolla toda la metodología necesaria para que una vez conseguida financiación se pueda proceder de inmediato con la obtención de las muestras y el análisis genotípico.

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El triptófano (abreviado como Trp o W) es un aminoácido esencial en la nutrición humana. Es uno de los 20 aminoácidos incluidos en el código genético (codón UGG). Se clasifica entre los aminoácidos apolares, también llamados hidrófobos. Es esencial para promover la liberación del neurotransmisor serotonina, involucrado en la regulación del sueño y el placer. Su punto isoeléctrico se ubica a pH=5.89. La ansiedad, el insomnio y el estrés se benefician de un mejor equilibrio gracias al triptófano.

Fuentes de triptófano

El triptófano es un aminoácido esencial, es decir, que sólo se obtiene a través de la alimentación. Abunda en los huevos, la leche, los cereales integrales, el chocolate, la avena, los dátiles, las semillas de sésamo, los garbanzos, las pipas de girasol, las pipas de calabaza, los cacahuetes, los platanos, la calabaza y la espirulina. Las personas que no ingieren estos alimentos tienen mayor riesgo de deficiencia de triptófano así como aquellas personas sometidas a altos niveles de estrés. Para un buen metabolismo del triptófano se requieren niveles adecuados de vitamina B6 y de magnesio.

Propiedades del triptófano

• Como aminoácido esencial ayuda a que el organismo elabore sus propias proteínas.
• El triptófano es esencial para que la glándula pineal segregue la serotonina, que es un neurotransmisor cerebral.
• Favorece el sueño, ya que la serotonina es precursora de la hormona melatonina, vital para regular el ciclo diario de sueño-vigilia.
• En algunos casos se observa un efecto antidepresivo debido a la serotonina.
• El efecto tranquilizante de la serotonina actúa con un ansiolítico.
• El triptófano es muy útil en problemas de obesidad donde el componente ansioso sea muy importante (por ejemplo en bulimias). El triptófano ayuda a que la serotonina controle el apetito evitando así la típica ansiedad por la comida, sobre todo en aquellas personas que no pueden dejar de comer todo el día.
• Al actuar sobre el estrés nos puede ayudar "de rebote" a controlar los niveles de insulina, ya que esta hormona acusa, en gran manera, el estado de nuestro sistema nervioso.
• En casos de agresividad debido a tensión nerviosa por ansiedad.
• Ayuda a la formación de vitamina B3 o niacina. De hecho, con cada 60 miligramos de triptófano en la dieta, nuestro cuerpo elabora 1 mg de niacina.
• Es muy importante tomarlo media hora antes de los alimentos o fuera de las comidas ya que si no, actúa como simple aminoácido o proteína, pero no efectúa su función beneficiosa sobre el sistema nervioso.
• El triptófano no debe usarse junto con medicamentos antidepresivos o tranquilizantes sin el consentimiento de un médico especialista.
• El L-5-Hidroxitriptófano (5-HTP) es una variante más eficaz que el triptófano.

El triptófano es un aminoácido esencial o sea que sólo se obtiene a través de la alimentación. Abunda en los huevos, la leche y los cereales integrales.

Las personas que siguen una dieta vegetariana sin huevos ni productos lácteos tienen mayor riesgo de deficiencia de triptófano así como aquellas personas sometidas a altos niveles de estrés.

Para un buen metabolismo del Triptófano necesitamos que nuestro organismo tenga los niveles adecuados de vitamina B6 y de Magnesio.

Propiedades del triptófano

• Como aminoácido esencial ayuda a que el organismo elabore sus propias proteínas.
• El triptófano es esencial para que el cerebro segregue la Serotonina que es un neurotransmisor cerebral.
• Favorece el sueño ya que la Serotonina es precursora de hormona Melatonina vital para regular el ciclo diario de vigilia-sueño.
• En algunos casos se observa un efecto antidepresivo debido a la Serotonina.
• El efecto tranquilizante de la Serotonina actúa con un efecto antiansiedad o ansiolítico.
• El triptófanoes muy útil en problemas de obesidad donde el componente ansioso sea muy importante (por ejemplo en Bulímias) El Triptófano ayuda a que la Serotonina controle el apetito evitando así la típica ansiedad por la comida, sobre todo en aquellas personas que no pueden dejar de comer todo el día.
• Al actuar sobre el estrés nos puede ayudar "de rebote" a controlar los niveles de insulina ya que esta hormona acusa, en gran manera, el estado de nuestro sistema nervioso.
• En casos de agresividad debido a tensión nerviosa por ansiedad.
• Ayuda a la formación de vitamina B3 o Niacina. De hecho con cada 60 miligramos de triptófano a partir de la dieta nuestro cuerpo elabora 1 mg. de Niacina.

¿Sabías que el triptófano...?

Es muy importante tomarlo media hora antes de los alimentos o fuera de las comidas ya que sino actúa como simple aminoácido o proteína pero no hace la función beneficiosa del sistema nervioso que buscamos.

El triptófano no debe usarse cuando estamos tomando medicamentos antidepresivos o tranquilizantes sin el consentimiento de nuestro médico o especialista.

El L-5-Hidroxitriptofano (5-HTP) es una "versión" del Triptófano más eficaz.

Varios estudios han demostrado que la concentración de serotonina en el cerebro es directamente proporcional a la concentración del triptófano en el plasma y el cerebro. La ingesta dietética de triptófano influye en la cantidad de serotonina en el plasma, el cerebro y los niveles en todo el cuerpo. Esta fue la primera demostración, realizada en 1980, en la que se acepta que un neurotransmisor cerebral está controlado por la dieta, concretamente por un simple aminoácido.

El metabolismo del triptófano es complejo y tiene muchos procesos. Requiere de una cantidad adecuada de vitamina B6 y magnesio para desempeñar su función de manera adecuada. La vitamina B-6 está involucrada en la conversión de triptófano en serotonina.

¿Cuáles son sus funciones?

Es uno de los aminoácidos esenciales para que el organismo elabore sus propias proteínas. Las neuronas (células nerviosas) lo utilizan para producir serotonina, un mensajero químico que entre otras funciones corporales, favorece la relajación. Y además, con cada 60 miligramos de triptófano dietético, nuestro organismo elabora 1 mg de vitamina B³ (niacina).

¿Cuáles son nuestras necesidades?

Los valores propuestos por la OMS para un adulto son de 3,5 mg por kilo de peso al día. Para calcular la cantidad ingerida, suele aceptarse que las proteínas de la dieta contienen un mínimo del 1% de triptófano. Así, una dieta con 60 gramos de proteínas proporcionarán 600 mg de triptófano, es decir, casi más del doble de lo recomendado.

¿Dónde se encuentra?

El triptófano es uno de los aminoácidos esenciales presente en las proteínas de origen animal, por lo tanto, las principales fuentes son los huevos y la leche, seguidos de pescados, carnes. También abunda en los cereales integrales.

¿Cómo se detecta la deficiencia?

A menudo, las deficiencias de niacina (vitamina B3) y triptófano se combinan con la de vitamina B⁶. Ello se debe a que la transformación del triptófano en niacina depende de esa última vitamina. Es habitual el dolor en la boca, con lengua y mucosas rojas y doloridas.

Por otra parte, el sistema serotoninérgico tiene una estrecha relación con la ingesta alimentaria. La serotonina influye en la ingesta alimentaria por mecanismos neuro-bioquímicos y la ingesta alimentaria influencia el sistema serotoninérgico, alterando la disponibilidad de triptófano y, en consecuencia, el grado de síntesis del neurotransmisor. La serotonina actúa sobre los núcleos de control del apetito, disminuyendo el hambre y la ingesta de alimentos.

En las personas que padecen bulimia nerviosa , se han realizado algunos estudios administrando un suplemento de triptófano, éste parece disminuir la apetencia por los alimentos en general y en especial el "picoteo" de los alimentos ricos en hidratos de carbono.

¿Quién tiene mayor riesgo de déficit?

Durante la infancia, las necesidades de aminoácidos esenciales son mayores. También aquellas personas que siguen una dieta vegetariana sin huevos ni productos lácteos tienen mayor riesgo de deficiencia.

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